麥芽汁進到發酵槽後，緊接著要加入酵母菌（yeast）。酵母菌為一種單細胞真菌，能夠將糖分發酵，生成酒精。而酒廠用來發酵的酵母菌為釀酒酵母（學名：Saccharomyces cerevisiae），又稱麵包酵母或啤酒酵母。不僅釀酒，製作麵包、饅頭…等食品也都會用到釀酒酵母。
- 化學式：C6H12O6 → 2C2H5OH + 2CO2+ 2ATP
- 文字式：醣類（葡萄糖、果糖或蔗糖）→醇類（乙醇）+二氧化碳+能量
以上化學式與文字式說明了麥芽汁裡的糖分轉化成酒精的過程。在缺乏氧氣時，釀酒酵母會進行缺氧呼吸作用，當中通過糖酵解作用將葡萄糖轉化成丙酮酸，其後丙酮酸經脫碳作用脫去碳原子，形成乙醛，同時釋出二氧化碳CO2，乙醛再被於糖酵解作用產生的NADH2還原成乙醇並產生能量（ATP）。而乙醇的俗稱就是酒精。
而釀酒酵母底下，又分為許多不同種類，啤酒跟威士忌使用的釀酒酵母就不一樣，但是蘇格蘭酒廠，講到酵母的時候，往往輕描淡寫到了有點簡略的程度，原因可能是，一般說來，蘇格蘭的威士忌廠絕大多數採用的是同一種釀酒酵母菌株（註1）。威士忌使用釀酒酵母，最重要的著眼點是能生成更多的酒精，確保發酵過程更快速、更完整，將泡沫的生成降至最低，並創造出獨特的風味。甚至有些釀酒廠也會加入乳酸菌來幫助發酵。
麥芽汁發酵完成後，二氧化碳會上升，在酒汁上層形成泡沫，最後揮發至空氣中，發酵完的酒汁酒精濃度不會太高，約略6％～10％間，與啤酒類似（只差沒有加入啤酒花），又被稱為麥酒汁（wash）。
事實上，發酵時間的長短與釀酒酵母的種類，對於麥芽威士忌的風味都是有影響的。
在發酵過程中，能夠影響麥芽威士忌風味的因素，大致就是「時間」與「酵母菌」。
時間
一、短時間：發酵時，酵母會攝取糖，並將它轉化成酒精（這時的液體稱為麥酒汁），這個過程會在48小時內完成，為「短時間發酵」，最終完成的麥芽威士忌會有較突出的麥芽特質。
二、長時間：「長時間發酵」（超過55小時）會發生酯化，生產出較輕盈、更複雜、具果香的風味。（然而，如果發酵時間過長，容易產生細菌，導致酒精產量不足，進而影響威士忌風味，因此發酵的時間掌控是相當重要的。）
酵母菌
酵母菌將麥汁分解，產生酒精及二氧化碳之外，也會生成微量的有機酸，這些微量的有機酸經過長時間的存放，會漸漸和酒精反應成具有特殊風味的酯（也就是酯化反應）。如同人有不同性格、星座、血型，酵母菌也有不同屬性。不同的酵母菌，生成的酯也不同。
我們知道不同種類的酯會產生不同的香氣，常見的有蘋果、草莓、葡萄、鳳梨等果香，茉莉花、薰衣草、鼠尾草等的花香，以及蜜糖、奶油等的甜點香氣，比較特別的甚至還有指甲油去光水、模型膠水等千奇百怪的味道。
而威士忌的釀酒師就像香水的調香師一般，運用種類繁多的酯，混合出獨特而迷人的風味，這也是為什麼我們經常說，「這支威士忌有太妃糖、水果蛋糕的味道」「那支威士忌有果乾、蜜餞的味道」，並不是說這支威士忌真的加了蛋糕、泡過蜜餞，而是酵母菌如魔法般的化學反應，以及釀酒師精心的設計。
以蘇格蘭威士忌來說，由於整個蘇格蘭威士忌產業大致上使用的都是同一種酵母，因此蘇格蘭威士忌在風味上的差別並非來自於酵母。但有些地區的酒廠則會使用甚至是研發不同品種的酵母，在麥芽威士忌中創造出酒廠想要的風味。如日本的山崎Yamazaki就有自己的酵母實驗室，針對3,000種不同的酵母進行研究，其中相當聞名的是實驗室研發的「飢餓酵母」，特色是液胞膨脹較大，糖原顆粒較少，可以在發酵過程中產生醇厚而獨特的芳香。（原文出處「藏Q酒論壇」）
註1
威士忌作家Dave Broom在《Baffled by Yeast》一文中曾經提到：「since all distilleries use the same yeast strain, the flavour differences which do exist are not generated by the yeast…既然所有的（蘇格蘭）蒸餾廠都使用相同的酵母菌株，那麼這些確確實實存在的風味差異就不是由酵母造成的…」參見Scotchwhisky.com網站。
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